1.外周血象 白细胞总数正常或稍增多。
2.病毒分离 是确诊的主要方法，具有节省、快速和准确的优点，而避免了血清学方法所遇到的血清型繁多的困难。
从粪便中分离病毒的阳性率最高，起病后10天内仍可阳性。在起病前36h及发热期间可从血中分离出病毒。呼吸道感染者可从咽拭或含漱液中分离病毒。脑脊液中分离病毒阳性率较低，但确诊意义较大。其他标本包括胸腔积液、心包积液、尿液、肌肉活检组织和尸检神经组织均可送检。粪便标本可保存于4℃多日，其他标本需保存于-7℃以下。
从粪便及呼吸道中分离出病毒仅具有参考意义，因为可能是合并感染。而从血液、脑脊液和心包积液中分离出病毒则具有确诊意义。所以应尽可能从多个来源采集标本，以增加结果的可靠性。
柯萨奇A组病毒除A9和A16血清型可用细胞培养分离病毒外，其余血清型均需通过各种途径(皮下、腹腔内、脑内等)接种乳小鼠来分离病毒。先观察病理变化，然后用特异性抗血清作中和试验加以证实。最近采用RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞)株可分离培养出除柯萨奇A1、A19、A22型病毒以外的其他A组病毒。
分离柯萨奇B组病毒以组织培养为首选，常用细胞株有猴肾、人胚肾和Hela细胞，采用非洲绿猴肾(BGM)细胞株和RD细胞株效果更佳。2～5天后先观察细胞病变作初步诊断，然后用特异性抗血清作中和试验加以鉴定。全过程约需1～3周，但作为临床确诊可不必等待血清型的鉴定结果。
3.血清学检查 由于血清型繁多，仅在下列情况下才适用：①已分离出病毒，作为确定血清型时;②已发现特征性临床表现如流行性胸痛，明显指示采用某些特定抗原(如B组病毒)来检测抗体时;或手、足、口腔病通常由柯萨奇A16型病毒所引起时;③正在发生由单一血清型病毒引起流行时;④用于某一特定血清型的血清流行病学调查时。
血清学检查方法中，中和试验是鉴定已分离病毒血清型最特异的方法。但作为检测肠道病毒感染的抗体，则中和试验还不够敏感，而且操作繁复，价格昂贵。患者在病程第2周开始出现中和抗体，2～3周后达高峰，并保持3～6年。补体结合试验的特异性较低，异型抗体出现率较高。但补体结合抗体与中和抗体同时出现，而仅保持2～3个月，可作为近期感染的依据。血凝抑制试验用途不大，因仅1/3肠道病毒产生红细胞凝集素，甚至在同一血清型也可有部分毒株产生而其余毒株不产生红细胞凝集素。最近有报告采用免疫印迹法检测IgM型肠道病毒抗体，阳性率达60%，大多数为群特异性(22/31)，少数为型特异性。有报道以热处理病毒为抗原和以合成多肽为抗原作ELISA法检测IgG抗体，其敏感性(以病毒分离为对照)分别为0.67和0.62，高于补体结合试验。在病毒分离阴性的56例中，IgG-ELISA法双份血清滴度有显著升高者分别为13和19例，适用于临床诊断。
近年来陆续报道用PCR法检测血清中肠道病毒RNA，具有很高灵敏度和特异性，阳性率显著高于细胞培养分离病毒。
从病人咽拭子中分离相同病毒。