由于临床表现无特异性，确诊有赖于病原学和血清学诊断。
常用方法有：
（1）酶联免疫吸附试验检测孕妇血清巨细胞病毒IgG、IgM；
（2）孕妇宫颈脱落细胞或尿液涂片行Giemsa染色后，在光镜下检测脱落细胞核内嗜酸性或嗜碱性颗粒，见到巨大细胞包涵体，这种特异细胞称猫头鹰眼细胞，具有诊断价值；
（3）DNA分子杂交技术检测巨细胞病毒DNA，此法简便、快速、敏感；
（4）PCR技术扩增巨细胞病毒DNA，短时间内获满意结果。有资料表明，我国孕妇巨细胞病毒感染率为8.82％，新生儿脐血清巨细胞病毒IgM阳性率为2.32％；分子杂交技术检测孕妇血白细胞巨细胞病毒DNA阳性率为8.7％，母乳汁巨细胞病毒DNA阳性率为10.26％。先天性巨细胞病毒感染的诊断，除根据孕妇感染巨细胞病毒史和患儿的临床表现外。主要根据实验室检查结果确诊。若为宫内感染，出生时从新生儿尿液或脑脊液中能检出巨细胞病毒包涵体，或从脐血或新生儿血中检测出巨细胞病毒IgM，具有诊断价值。若为产道感染，至少于生后2周方能从新生儿尿液中检出巨细胞病毒包涵体。此外，新生儿尿液、胃洗出液、脑脊液沉渣作涂片并染色后，在光镜下查到巨大细胞内含典型嗜酸性核内包涵体，同样具有诊断价值。