尿17-酮类醇水平高于同性别同年龄的正常者。尿中孕酮水平早期升高(这比尿17-KS的水平更为敏感，因孕酮是雄激素的前体)，血17-羟孕酮水平升高是最敏感的指标，适用于儿童，染色体检查正常。X线检查会发现骨龄早化。侧位尿道膀胱造影会显示阴道，尿道和膀胱。CT扫描可见高度增生的肾上腺。尿道镜可看清开口于尿道后壁的阴道，也能进入阴道并看到子宫。
1.ACTH1～24兴奋试验对于经典型21-羟化酶缺陷症病人，根据临床表现和基础17-OHP，一般可以明确诊断。血清17-OHP基础值不能提供足够的诊断依据时，有必要进行ACTH1～24兴奋试验。一般而言60min时17-OHP水平在10ng/ml以上考虑非经典型21羟化酶缺陷症的诊断。每个实验室都应根据21羟化酶缺陷症杂合子携带者和正常人确定出自己的诊断标准。
对于新生儿。如果根据外生殖器两性畸形怀疑CAH，ACTH1～24兴奋试验必须推迟到出生24h后进行。如果在出生后马上取标本则会有较高的假阳性率和假阴性率。
ACTH1～24兴奋试验还有助于鉴别诊断。在其他酶缺陷的CAH病人中17-OHP也会升高，如11β-羟化酶缺陷症或3β-羟类固醇脱氢酶缺陷症。为了鉴别各种酶缺陷，最好的方法是在0，60min检测17-OHP，DOC，皮质醇及11-脱氧皮质醇、17-羟孕烯醇酮、DHEA和雄烯二酮。如果是幼小的婴儿，采血量是个问题，则可以只在60min时取血。前体物质与产物的比值对鉴别各种酶缺陷尤为有用。如果诊断仍不明确，应该对患者进行试验性治疗，然后在糖皮质激素部分减量或完全终止后再次检查。
2.失盐的检查PRA(血浆肾素活性)值升高，特别是PRA与24h尿醛固酮比值增加标志着醛固酮合成障碍。在循环血中ACTH，17-0HP和孕酮水平高，但醛固酮水平正常的病人中这些指标也会升高，这样没有很好控制的单纯男性化病人生化表现会与失盐型混淆。盐皮质激素治疗可以对这些病人肾上腺抑制，有助于二者的鉴别。理想状态下，血浆和尿醛固酮水平应该与PRA和钠平衡相关，从而有助于对临床类型的准确判断。在分析肾素水平的意义时，必须注意新生儿正常值高于年龄较大的儿童。
3.用于诊断和监测21-羟化酶缺陷症的其他激素其他一些生化诊断实验可供考虑，但目前很少能广泛开展。21-脱氧皮质醇能够检测出超过90%的CAH携带者。雄激素代谢物(3α-雄烷二醇葡萄糖苷酸)的水平在非经典型21-羟化酶缺陷症病人中升高，与雄烯二酮和睾酮水平高度相关。17-OHP尿中的主要代谢物孕三醇也可用于21-羟化酶缺陷症的诊断。另外，尿孕三醇葡萄糖苷酸可以用于监测治疗效果和是否治疗过度。作为酶联免疫分析或RIA的代替方法，尿类固醇代谢物可以通过GS/MS方法检测，这种方法可以使CAH和其他类固醇代谢疾病相关指标同时得到检测。
1.性染色体检查女性细胞核染色质为阳性，男性则为阴性，女性染色体计数性染色体为XX，男性则为XY,可确定其真正性别。
2.B型超声检查先天性肾上腺皮质增生女性假两性畸形的内生殖器正常，B超和经插管X线造影能显示子宫和输卵管。B超、CT、MRI有助于鉴别肾上腺增生或肿瘤，先天性增生为双侧肾上腺对等增大，而肿瘤多为单侧孤立肿块，可有钙化，因出血和坏死可形成液化腔。
3.其他女性肾上腺皮质增生假两性畸形者，用尿道镜检查尿生殖窦，可见阴道开口于子宫颈，若家族中有21-羟化酶缺乏者，可采用聚合酶链式反应(PCR)、羊膜细胞HLA分型和DNA进行分析。