需与慢性化脓性骨髓炎、尤文氏肉瘤、转移性骨肿瘤鉴别。
慢性化脓性骨髓炎髓腔弥漫性密度增高，皮质增厚，但无骨质大块破坏或肿瘤骨形成，软组织肿胀亦不明显。若见死骨存在，骨髓炎的诊断更明确。
尤文氏肉瘤表现为髓腔内斑点状、鼠咬状溶骨破坏，范围较长，多见葱皮样骨膜反应。
转移性肿瘤较少侵犯膝关节附近的骨胳，好发于骨盆及脊柱等，骨质改变多为溶骨性，大多无骨膜反应和软组织肿块。
在诊断骨肉瘤时，应排除其他肿瘤，如骨母细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤，以及转移性骨肿瘤等。骨干上的骨肉瘤有时会与Ewing肉瘤混淆。其他如Brodie脓肿、骨髓炎、骨结核，甚至骨痂，有时也会被误诊为骨肉瘤。术前结合临床表现与影像检查和穿刺活检是必要的鉴别诊断手段。
