应根据病史及溃疡的特点，必要时作分泌物涂片，培养，梅毒血清学实验等以明确诊断。
对生殖器疱疹行脱落细胞学检查，酶联免疫测定法。
对软下疳分泌物涂片检查，分泌物培养，伊东-雷斯特纳（Ito-Reenstieno）反应等可查到病原体。
性病性淋巴肉芽肿的辅助检查：血清补体结合试验，稀释16～64倍为阳性；涂片找细胞内包涵体；鸡胚和细胞培养分离衣原体等。
梅毒病原体检查，即暗视野检查，在一期梅毒的硬下疳可取少许血清渗出液或淋巴穿刺液放于玻片上，滴加生理盐水后置暗视野显微镜下观察，依据螺旋体强折光性和运动方式进行判断，可以确诊。
感染性疾病进行基因诊断：用聚合酶链反应（PCR）诊断生殖器感染具有快速，准确和灵敏度高的特点。
软下疳作组织病理检查：软下疳有时同时感染梅毒，性病性淋巴肉芽肿，腹股沟肉芽肿，阴道疱疹等，可检出相应致病微生物。
梅毒血清学检查：此类检查主要是检测患者有无抗心质抗体（反应素）存在，密螺旋体抗原血清试验，测定血清特异性抗体。
