结膜囊分泌物分离培养非典型分枝杆菌。用Ziehl-Neelsen染色法可显示抗酸杆菌存在。在30℃环境中作Löwenstein-Jeusen培养有抗酸杆菌生长(37℃很少生长)。由于该培养需时较长、几周时间才能呈阳性，只要在活检组织中发现特征性抗酸杆菌可足以做出巩膜分枝杆菌感染的诊断。结核菌纯化蛋白(protein-purified derivative，PPD)皮肤试验阳性可确定特定的非典型分枝杆菌，而其他的细菌阴性有助于诊断。用角膜或巩膜活检组织标准染色和培养不能分离出分枝杆菌。
超声波检查可以发现隐匿存在的巩膜葡萄肿。