培养阳性，并经生化鉴定为假单胞菌可以确诊。可在选择培养基上并产生绿脓色素的即可鉴定为铜绿假单胞菌，若无色素或在鉴别培养基上不发酵乳糖或葡萄糖的革兰阴性杆菌，可行以下方法进一步鉴别。
1.色素鉴定 可将细菌接种于King A、B斜面培养基，37℃ 24h或置室温观察5天。
(1)绿脓色素：在King A斜面上呈深绿色，液体培养基接触空气处绿色明显。若色素不明显或混杂其他色素，可加氯仿于斜面，置室温观察1～24h，如仍不明显，可在氯仿液中滴加稀盐酸，绿脓色素在酸液层呈红色。
(2)绿脓荧光色素：铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌在King B斜面培养基上呈现黄绿色荧光。
(3)红脓色素：在King A斜面培养基上呈红紫色，如置37℃ 24h红色不明显，可再置室温3～5天观察。铜绿假单胞菌产生红脓毒素者较少见。
(4)黑脓毒素：铜绿假单胞菌在含蛋白胨培养基中生长时常有黑脓毒素产生。嗜麦芽窄食单胞菌也有黑脓毒素产生。
2.其他鉴定 绿脓杆菌和其他假单胞菌的主要鉴别是葡萄糖氧化分解、氧化酶、精氨酸双水解、乙酰胺酶、葡萄糖酸氧化、硝酸盐还原产氨试验均为阳性。绿脓杆菌败血症患者尿中出现铜绿色蛋白尿，将患者尿液调成酸性、碱性和中性，置于暗室分别用紫外线照射，如有铜绿蛋白尿则发生淡绿色荧光。
