一、什么是荧光检测

荧光检测是一种自然发光反应，通过荧光素酶与ATP进行反应，可检测人体细胞、细菌、霉菌、食物残渣，在15秒钟内得到反应结果。光照度通过专用设备进行测量，并以数字形式予以表示，在1975年首先被应用到食品工业中，在1985年在化妆品制造业中得到应用。

荧光检查法是一种妇科生殖系统疾病检查诊断方法，比传统的肉眼观察法更客观，灵敏度更高，实用性更强。提高妇科检查结果的准确性，有利于及时诊断病症，起到早治疗早康复的效果，更能进行宫颈癌和一些瘤变病症的的早期筛查，保护妇女健康。在皮肤病中适用于细菌、病毒、衣原体、支原体等病原体感染的快速诊断，以及红斑狼疮、疱疹样皮炎、类天疱疮等病的诊断。用以检查病人的皮肤组织中有无免疫球蛋白或补体沉积，用特异荧光抗体直接滴加于待检的标本上，由荧光标记的抗体与抗原发生特异结合。使之呈现荧光，根据荧光分布和形态确定抗原部位和性质。

二、荧光检查法的详细情况

（1）直接免疫荧光法

用以检查病人的皮肤组织中有无免疫球蛋白或补体沉积，用特异荧光抗体直接滴加于待检的标本上，由荧光标记的抗体与抗原发生特异结合。使之呈现荧光，根据荧光分布和形态确定抗原部位和性质。此法用已知的抗体检查未知的抗原，但一种标记抗体只能查一种抗原，可直接采用病人的病变组织。如：红斑狼疮、疱疹样皮炎、类天疱疮等作冰冻切片，荧光染色。此法简单、特异。 　　

采集标本后，直接涂于载玻片上，自然干燥后，丙酮固定10分钟，待丙酮完全挥发后，加30 l特异性的荧光素标记的抗体，室温湿盒内孵育30min，使标记的抗体与抗原发生特异性结合，取出后 蒸溜水冲洗去未结合的抗体，置荧光显微镜下观察。

（2）间接免疫荧光法

用以检测病人血清中是否存在某种特异抗体或自身抗体，反应中的两对抗原抗体相对应的特异结合，而第二抗体（荧光抗体）则针对第一抗体的结合体，由于第一抗原分子可与若干个抗体分子结合，因而第二结合反应后，灵敏度大大提高。本法常用于各种自身抗体的检测。如：系统性红斑狼疮、硬皮病等。 　　

标本采后，保存于转送培养基中，临用前混匀后取悬液涂片，固定后加入50 l用PH 7.2 PBS 1:16稀释的特异性抗体，35℃孵育30分钟，取出后用PH 9.0的0.01 M的磷酸盐缓冲液浸泡10分钟，干燥后用50 l 1:500稀释的荧光抗体（第二抗体），35℃孵育30min，蒸溜水冲洗，干燥后甘油封固加盖玻片镜下观察。

三、荧光检测的主要缺点

荧光检测是一种自然发光反应，通过荧光素酶与 ATP进行反应，可检测人体细胞、细菌、霉菌、食物残渣，在15秒钟内得到反应结果。光照度通过专用设备进行测量，并以数字形式予以表示，在1975年首先被应用到食品工业中，在1985年在化妆品制造业中得到应用。

荧光检测的主要缺点在于只有少数化合物产生荧光。大多数的分子不发荧光，但含有可衍生的官能团用于合成能发荧光的衍生物，例如，邻苯二甲醛是一种常用荧光基团用于柱后衍生氨基酸。虽然荧光检测很灵敏，但对于常见的样品分析来说不需要如此高的灵敏度。因为ELSD的响应不依赖于荧光基团，所以不需要衍生，因此大大降低了样品预处理和分析时间。

此外，荧光免疫检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点，因此它被用于测量含量很低的生物活性化合物，例如蛋白质（酶、接受体、抗体）、激素（甾族化合物、甲状腺激素、酞激素）、药物及微生物等 。

四、荧光检测使用方法

流式

优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全 不用担心荧光淬灭的问题。缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。

荧光显微镜

刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。

共聚焦

荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。另外，4Pi和STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。