一、革兰氏染色的原理

　　原理：革兰氏染色目前有三种观点：等电点学说、化学学说和渗透学说.

　　1. 等电点学说,革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3,比阴性菌(PH4-5)低,加之碘为弱氧化剂,可降低革兰氏阳性菌的等电点,致使两类菌的等电点差异扩大,因此阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强.

　　2.化学学说,碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合,此结合物不易被丙酮酒精脱掉,呈革兰氏染色阳性.因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐,故对碘与结晶紫结合物摄取少,且不牢固,易被丙酮酒精脱色而呈革兰氏染色阴性.

　　3.渗透学说,乙醇使阳性菌所含粘肽多糖脱水而致细胞壁间隙缩小,通透性降低,在菌体内保留了染料-碘复合物,呈紫色.阴性菌含粘肽少,细胞壁变化不大,通透性不受影响,菌体内的染料-碘复合物较易透出,失去紫色,被复染成为红色.

　　[试剂]：Crystal violet(结晶紫)、Gram Iodine(碘液)、Decolourizer(丙酮酒精)、Safranin(稀释沙黄)

二、什么是白色念珠菌

　　白色念珠菌是念珠菌的一种，而念珠菌是霉菌的一种。白色念珠菌（Monilia albican 或 canidia Albicans）通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式（芽生菌丝相）侵入细胞引起疾病。阴道炎最常见的原因是一种属于霉菌的白色念珠菌感染。念珠菌是阴道内的一种常见菌种。在月经或生产期前后，霉菌与细菌之间正常的平衡被破坏时，念珠菌数量会急速增加而造成感染。白色念珠菌念珠菌可存在人的口腔、肠道、阴道粘膜而不引起症。

　　1、白带较多、白色粘稠、豆渣样或凝乳状。

　　2、外阴、阴道搔痒，有烧灼感，排尿时症状尤为明显。

　　3、频尿、小便痛及性交痛。

　　4、小阴唇内侧及阴道粘膜红肿，并附有白色片状薄膜，擦除该膜后基底部出现糜烂或表浅溃疡。

　　5、白色念珠菌好发于孕妇、糖尿病患者、接受贺尔蒙治疗患者、长期使用抗生素、长期使用类固醇、使用免疫抑制剂、及爱滋病患者。

　　6、工作压力大、熬夜、营养不良、常穿紧身裤或牛仔裤、惯用护垫、工作性质需久坐者、有阴道灌洗习惯的人亦常遭白色念珠菌的感染。

　　治疗上，除了要改变上述的生活习惯外，可用阴道塞剂及外阴软膏，若不能使用塞剂时，则可以用口服抗霉菌药。长期不愈者最好先生也要一起治疗。

三、什么是革兰氏染色

　　革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。革兰氏阳性菌：葡萄球菌属(主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、链球菌属(肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等)、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌革兰氏阳性菌通常对青霉素类、第一(或第二)代头孢菌素、万古霉素、克林霉素等高度敏感，但是因为抗生素的滥用，MRSA/MRSE、VRSA/VISA、PISP/PRSP、VRE等多重耐药菌已经严重威胁着人类的生命，这些细菌感染时，可以考虑使用万古霉素、共杀素(奎奴普丁/达福普丁)、利奈唑胺、达托霉素、泰利霉素、夫西地酸(建议与耐酶的青霉素类或利福平联用)等。另外，CNS(凝固酶阴性葡萄球菌)等细菌也要引起足够等重视。革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属(绿脓杆菌等)、莫拉菌属(卡他莫拉菌等)、奈瑟菌属(淋球菌、脑膜炎双球菌等)、不动杆菌属(鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等)、克雷伯菌属(主要是肺炎克雷伯杆菌)、沙门氏菌属、志贺氏菌属(痢疾杆菌等)、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属(杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等)、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金属酶”(NDM-1)的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌(主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌)。根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。

四、白色念珠菌革兰氏染色

　革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色.具体步骤：

　　涂片

　　首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。

　　固定

　　将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。

　　染色

　　在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗，注意水流不要直接对准薄层。

　　媒染

　　加路哥式碘液大概一滴，作用1 min后用水冲洗，注意流水不要直接往薄层上冲，用过滤纸吸干。

　　脱色

　　用95%乙醇脱色，一般脱色时间大概为30 s。这一步是革兰氏染色的关键，必须严格掌握好，如果脱色时间过长则会把阳性菌误认为阴性菌;如果脱色不够则容易被误认为是阳性菌。

　　水洗后用过滤纸吸干。

　　复染

　　滴加0.5%的番红染色一滴，液染色10～30 s后，用自来水冲洗。

　　观察

　　干燥后，用油镜镜检观察，并做好记录。