确诊脑膜炎是通过腰穿作脑脊液检查，对任何怀疑有败血症的新生儿应作此项检查。然而新生儿腰穿比较困难，有造成缺氧的危险。患儿临床情况差导致腰穿更危险(如呼吸窘迫，休克，血小板减少)，如果腰穿延迟，婴儿应作为脑膜炎治疗。即使临床情况改善，在发病数日后脑脊液中出现的炎性细胞和异常化学物质，依然可提供有价值的脑膜炎存在的材料。作新生儿腰穿的穿刺针要有一个套针，避免上皮细胞残留而可能发展为上皮瘤。脑脊液即使是血性或无细胞的，也应该作培养。约15%血培养阴性病例有脑脊液培养阳性，对革兰氏阴性病原菌病例应在72小时重复腰穿，以确信无菌。一些专家认为对GBS脑膜炎病例在24小时重复腰穿有预后价值。对任何临床反应有可疑的病例均应重复腰穿。在治疗末期对情况良好的病例不应常规重复腰穿。
新生儿脑脊液的正常值是有争议的，并与年龄有关。总的来说，低出生体重儿在生后4周内20个细胞/μl(多形核白细胞可达1/2)，蛋白质定量为160mg/dl，糖水平为50mg/dl(2。8mmol/L)是正常值的高限。对足月儿这些高限为10个细胞/μl(多形核白细胞可达1/2)，蛋白质定量为80mg/dl，糖为50mg/dl(2。8mmol/L)。由于脑脊液糖含量很大程度上依赖于血糖浓度，正常情况可低至20~30mg/dl(1。1~1。7mmol/L)。血糖浓度应在腰穿前测定，这样可以确定脑脊液糖/血糖的比值(<50%为异常)。
应怀疑对适宜的抗生素治疗无反应的任何新生儿存在脑室炎。有脑室穿刺液白细胞计数>100/μl，革兰氏染色阳性或培养阳性，脑室压力增高和脑室扩大时可作出诊断。当新生儿对治疗无反应，应怀疑脑室炎或脓肿，MRI或CT造影扫描对诊断有帮助。
